Canlı Hücrelerde Lipid çözünürlüğü: Hiperspektral Orta Kızılötesi Fotoakustik Mikroskopide Yeni Bir Atılım

Lipitler yalnızca hücre zarlarının ve enerji depolama moleküllerinin yapısal bileşenleri değildir, aynı zamanda kanser, obezite, diyabet, kardiyovasküler hastalıklar ve nörodejeneratif hastalıkların ortaya çıkması ve gelişmesiyle de yakından ilişkilidir. Bununla birlikte, canlı hücrelerdeki farklı lipit türlerini doğrudan gözlemlemek ve ayırt etmek uzun süredir teknik zorluklarla karşılaşmaktadır. Geleneksel floresan etiketleme yöntemleri, etiketleme verimliliği, özgüllüğü ve hücresel işlevlere olası müdahale nedeniyle sınırlıdır; etiketsiz optik teknikler ise genellikle benzer kimyasal yapılara sahip lipit moleküllerini ayırt etmekte zorlanır.

Nature Methods, "Hiperspektral Parmak İzi Bölgesi Fotoakustik Mikroskobu" (hyFOPM) adı verilen bir teknolojiyi tanıtan bir çalışma yayınladı. Orta kızılötesi parmak izi bölgesindeki tek bağ titreşim modlarını kullanan bu teknoloji, canlı hücrelerde sfingomiyelin (SM) ve kolesterolün (Chol) etiketsiz olarak tespit edilmesini ve dinamik olarak görüntülenmesini sağlar.

Teknik Esaslar
Etiketsiz optik yöntemlerin çoğu CH germe titreşim bölgesindeki (yaklaşık 2800–3000 cm⁻¹) sinyallere dayanır, ancak bu bölgedeki spektral bantlar çeşitli lipitler arasında oldukça benzerdir ve bu da farklı türler arasında ayrım yapmayı zorlaştırır. Buna karşılık, orta kızılötesi parmak izi bölgesi (900–1730 cm⁻¹), amid bağlarının, ester bağlarının ve steroid halkalarının karakteristik absorpsiyonu gibi moleküllerin benzersiz yapısını yansıtan daha fazla tek bağ titreşim bilgisi içerir.

hyFOPM sisteminin tasarımı bu konsepte odaklanmaktadır. Uyarma kaynağı olarak, 2 cm⁻¹ spektral çözünürlükle 900–2932 cm⁻¹ aralığını kapsayan ayarlanabilir bir kuantum kademeli lazer kullanır. Lazer darbeleri, hiperspektral görüntüler oluşturmak için ultrasonik bir dönüştürücü tarafından tespit edilen fotoakustik sinyaller üretmek üzere numuneyi uyarır. Sistem, yaklaşık 4,3 μm uzaysal çözünürlüğe sahip olup, canlı hücreler düzeyinde görüntülemeye olanak sağlar.

Lipid Modellerinin Doğrulanması
Teknolojinin fizibilitesini doğrulamak için araştırma ekibi ilk olarak kolesterol (Chol), doymamış fosfatidilkolin (DOPC) ve sfingomiyelin (SM) içeren iki boyutlu lipid çözelti modelleri hazırladı.

(1)Spektral Özellik Karşılaştırması

HyFOPM tarafından toplanan parmak izi bölgesi spektrumları ATR-FTIR sonuçlarıyla oldukça tutarlıdır. Üç lipit ayırt edilebilir spektral zirveler sergiler: kolesterol, 1056 cm⁻¹'de steroid halkası deformasyonu için güçlü bir emilim zirvesi sunar; DOPC, 1731 cm⁻¹'de ester grubunun C=O gerilme titreşimini içerir; ve sfingomiyelin sırasıyla 1645 cm⁻¹, 1555 cm⁻¹ ve 1464 cm⁻¹'deki amid I bandına, amid II bandına ve yağ asidi CH₂ bükülme titreşimine karşılık gelir.

(2)Spektral Ayrıştırma ve Sınıflandırma Yeteneği
Doğrusal karıştırma için parmak izi bölgesinde yalnızca 15 dalga numarası kullanıldığında, kolesterol ve sfingomiyelin arasındaki karışma %0'a yakınken, DOPC için karışma %23'tür. Buna karşılık, CH germe bölgesinde 7 dalga sayısı kullanıldığında karışma önemli ölçüde artar. Doğrusal diskriminant analizinin (LDA) daha ileri uygulanması, ortalama sınıflandırma doğruluğunun, parmak izi bölgesi veya CH bölgesi kullanıldığında %96'ya, tüm dalga sayıları kullanıldığında ise %97'ye ulaştığını göstermektedir.

(3)Dev Tek Katmanlı Kesecik (GUV) Modelleri
Çalışma, hücre zarlarını simüle etmek için üç tip GUV hazırladı: Model 1, yoğun düzenli bir zar oluşturan 1:1 SM ve Chol karışımı; Model 2, sıvı düzenli ve sıvı düzensiz fazlarda bir arada bulunan 2:2:1 DOPC, SM ve Chol karışımı; ve Model 3, düzensiz bir sıvı zarı oluşturan saf DOPC. hyFOPM tarafından 2852 cm⁻¹'de elde edilen görüntüler, Nil Kırmızısı floresan boyamayla elde edilenlerle morfolojik olarak tutarlıdır. Farklı veziküllerin spektral özellikleri saf lipitlere karşılık gelir ve bu da karışık membranlardaki ayrı ayrı bileşenlerin tanımlanabileceğini doğrular.

(4)Kalite Kontrol Uygulamaları
Araştırma ekibi, her tür için 10 farklı GUV üzerinde spektral ölçümler gerçekleştirerek ve üçlü faz diyagramları çizerek, gerçek lipit bileşiminin hedef orandan saptığını (yaklaşık %40'lık bir tutarsızlık) buldu. Bu, hyFOPM'nin GUV hazırlığında kalite değerlendirmesi için kullanılabileceğini gösterir.

Yaşayan Hücrelerdeki Uygulamalar
Çalışma ayrıca hyFOPM'yi canlı hücrelere uyguladı ve sırasıyla iki hücre modelinde sfingomiyelin ve kolesterolün dinamik değişikliklerini gözlemledi.

(1) A549 Hücrelerinde Sfingomiyelin Birikimi
İnsan akciğer adenokarsinomu hücreleri (A549), sfingomiyelin birikimini indüklemesi beklenen antitümör bileşiği 2-hidroksioleik asit (2-OHOA) ile tedavi edildi. Parmak izi bölgesi spektrumları (1600–1400 cm⁻¹) 50 hücreden toplandı; bu, 1464 cm⁻¹ tepe alanının aynı dönemde kontrol grubunda yalnızca %23'e kıyasla tedaviden sonra %117 arttığını gösterdi. Daha sonra, yalnızca dört dalga numarası (toplam lipitler için 2852 cm⁻¹, protein amid II için 1540 cm⁻¹, sfingomiyelin için 1464 cm⁻¹ ve kolesterol için 1048 cm⁻¹) kullanılarak 3000 hücre üzerinde görüntüleme gerçekleştirildi. Sonuçlar, sfingomiyelin sinyalinin tedaviden 48 ve 72 saat sonra yükselmeye devam ettiğini, kolesterol sinyalinde ise anlamlı bir değişiklik olmadığını gösterdi.

(2)HEK Hücrelerinde Kolesterol Yüklenmesi
İnsan embriyonik böbrek hücreleri (HEK293), hücre zarındaki kolesterolü arttırmak için bir metil-β-siklodekstrin-kolesterol kompleksi (MβCD-Chol) ile birlikte inkübe edildi. 50 hücrenin parmak izi bölgesi spektrumları, tedaviden sonra 1048 cm⁻¹ tepe alanının %161 arttığını, sfingomiyelin için 1464 cm⁻¹ tepe noktasının hafifçe azaldığını gösterdi; bu, siklodekstrinin kolesterol verirken bazı membran lipidlerini ekstrakte ettiği bilinen özelliğiyle tutarlıdır. 3000 hücrenin çok dalga sayılı görüntülemesi, kolesterol sinyalinin yükseldiğini, toplam lipit sinyalinde hafif bir artış ve protein sinyalinde çok az değişiklik olduğunu doğruladı.

Önem ve Görünüm
Bu çalışma, canlı hücrelerde benzer kimyasal yapılara sahip lipit moleküllerini etiketlemeden ayırt etme yeteneğini göstermektedir. Floresan veya izotopik etiketlemeye dayanan geleneksel yöntemlerle karşılaştırıldığında hyFOPM, etiketleme verimliliği ve hücresel işlevlere müdahale gibi sorunları ortadan kaldırır ve seçiciliği, uyarılma dalga numaralarını ayarlayarak hedef lipitlerin spektral özelliklerine esnek bir şekilde uyarlanabilir.

Mevcut sistemin parmak izi bölgesindeki spektral özgüllüğü CH germe bölgesininkinden daha üstündür ve bu da daha fazla lipit alt tipinin ayırt edilmesine yönelik olasılıkları açar. Çalışma ayrıca, derin öğrenme gibi gelişmiş spektral karıştırma tekniklerini birleştirmenin duyarlılığı ve özgüllüğü daha da artırmasının beklendiğine dikkat çekiyor. Ek olarak, orta kızılötesi fotoakustik mikroskopi dokuda 150 μm'nin üzerinde görüntüleme derinliğine ulaşabilir ve gelecekteki uygulamalar kalın numunelere veya in vivo ortamlara genişletilebilir. Teknolojik hızlandırma (örneğin, spektral yetersiz örnekleme) ve sistemin minyatürleştirilmesi, bu teknolojiyi bakım noktası analizine veya rutin laboratuvar testlerine doğru ilerletmek için önemli yönlerdir.